草菇菌种的提纯复壮初探


菌种的分离筛选是食用菌栽培过程中的重中之重。食用菌菌种在使用过程中会发生变异和退化,尤其是草菇的菌丝,生长和降解速度都很快。因此,需要定期引进或纯化复壮,以保证菌种的质量和稳定性,从而保证最终的产量。稳定奠定基础。 1、组织分离在草菇工厂化生产中,为保证品种的稳定性,大多采用定期组织分离、严格筛选的方式获得菌种。一般每次选择种菇,首先要选择出菇好(产量高、整体菇形适中、均匀度高)、菇房内无明显病虫害的菇房;其次,选择最好的蘑菇屋从床架上,选择最适合蘑菇的材料层;从材料层上最好的一层蘑菇中,挑选嫩草菇(5个半熟,呈小桃形)3到4个。摘下嫩草菇立即放入消毒过的或干净的塑料袋中,带与试管培养基一起送至菌种室的超净工作台进行分离。组织分离时,先用75%的消毒酒精对手、工具和蘑菇表面进行消毒(有经验的操作者可能不会对蘑菇表面进行消毒),然后用烧焦充分的手术刀在蘑菇表面做一个浅圆形切口纵面(不要切开外层菌帘),在种菇基部从中间剪一个小口,捏住种菇外侧剥去菇蕾,在菇体连接处浅切帽盖和菇柄用消毒冷却的手术刀呈“田”字形,每小块3-4mm见方(尽量不要切破菇肉触及鳃),直接将小块菇肉插入用刀夹试管培养基,用棉塞塞住。将菌肉小块轻拍至试管底部,置于29-31环境中培养。分离出的试管应达到24个左右,如因操作失误达不到,应补充合格的种菇,重新分离。 2 分离菌种的鉴定与筛选2.1 初步筛选1 一般经过3天左右的分离培养后,菌肉会长出白色菌丝。当丝长到2cm左右时,观察菌丝的生长情况: a基部菌丝整齐致密,细长而结实,呈银灰色,生长速度快;内层菌丝很稀疏,气生菌丝生长混乱,气生菌丝发白,气生菌丝比内苗多或感染杂菌,只要出现其中一种情况,就会被清除; 观察满管速度,记下满管时间; 观察厚垣孢子出现的时间早晚;选择先满的、先出现厚垣孢子的试管,保留最好的12株,不足的尽量保留。 2.2 初步筛选2 将剩余的12株菌株编号为VZ1~VZ12,取顶端菌丝转移至试管中,保持底部3cm不动,每管转移20~30个试管,并相应标记为VZlMI~VZ12M1; 管转移后剩余的菌种,在酒精灯下,打碎试管底部(可以用小砂轮在底部没有介质的地方打个记号,然后放在火焰上烤一会儿.如果没有破裂,用冷酒精棉球快速冷却将试管底部弄破),用消毒过的打孔器在底部打样品1-2cm(打孔器直径为4-5mm) ,打2排孔,每排2个孔;靠近底座的一排连接到板的中心,另一排排列到板的边缘;菌丝体表面的培养基,标记与转移管试管相同,置于29-31倒置培养; 转管试管筛选方法同下文“草菇母种转管筛选”;平板分为2块:连接中心的菌株主要比较菌丝形状、颜色、均匀度、是否有角度变化,剔除不稳定菌株;边缘连接的菌株主要比较各组的平均生长速度,如果平盖板上没有凝结水的,比较爬壁能力;经过综合评价,选出最好的8株。 2.3 复筛厚垣孢子出现后,将筛选出的8株试管置于20避光保存; 从8个菌株中挑出最好的1-2个平板接种原种,置于距接种块2cm处。取样采用打孔方式,每个样品接1袋原种,菌丝体表面附着在物料表面。每株取30袋,29-31避光培养,记录其生长速度,观察菌丝颜色及生长情况(原种子培养基必须按配方准确称量,严格控制材料配比加水,将物料混合均匀,装入袋中(重量、高度、松紧度相同)。 筛选出表现最好的4株,每株取原种20袋,20避光保存5袋,对15袋进行出菇试验。 3 出菇试验出菇试验是所有食用菌选育中最关键的一步。通过出菇试验,比较不同菌株的优缺点,筛选出适合不同菌株的生产模式。草菇组织分离板接种原种,将从外部引进并经转移管筛选的亲本转移至每株30袋原种中;当出现厚垣孢子时,每株选15袋较好的做蘑菇试验。 4株加进口种15袋,每组菌株5袋,3个重复; 沿底角剪去袋底,袋口留2cm,剪掉多余部分,整理在菇床架上; 喷出菇水:出菇水的温度和PH值与普通出菇水相同。总水量约为原种子干重的30%。调整情况,让底部不滴水,少而不多,防止因水分过多导致产量大幅减产。 出芽、出菇管理同常规。采收时记录采收时间和各组采菇重量,记录重量。统计分析时,每组去掉1袋最差的,比较平均生物转化率、开始出菇时间和清床时间;保留生物转化率最高、转化周期最短的2株菌株;淘汰菌株对应的保藏原种停止贮藏,保留2株对应的保藏原种在品种生产有效期内轮作栽培。 4 草菇母种转管筛选转管前种源在29-31培养24-48小时。转管时,保证空白斜面无结露,接种块尺寸一致,规格为3mm3mm4mm4mm,菌种直接落底,不要划伤培养基,29-31避光培养。 接种后24小时,观察发芽情况,正常发芽12小时; 接种后48小时,观察菌丝生长情况:基部a菌丝整齐致密,细长而结实,呈银灰色,生长速度快;气生菌丝具有较强的爬壁能力,并持续均匀生长; b.基部菌丝稀疏,气生菌丝生长杂乱,气生菌丝发白。需要消除这种情况; c相对a慢,标记后生长速度稍慢(部分种子块在接种时被烫伤,发芽慢所致,合格后可使用后期栽培指标); 接种72小时后观察气生菌,根据蚕丝的爬壁能力,剔除爬壁能力弱的; 接种后84-120小时,正常菌丝满管,不同培养天数的满管在对比检查时应做标记分离(分为3类);经过144小时的培养未满管的剔除;⑤接种后156~240h,正常菌丝出现砖红色厚垣孢子,每天检查,出现厚垣孢子后,标注出现日期,当天放置到18~22℃环境避光保存(保藏时将不同天数满管的分开放);培养240h未出现厚垣孢子的剔除。  注:斜面母种在30d有效保藏期内使用的,对于同一批次同一品种的,优先使用菌丝先长满的;在菌丝同一天长满的里面优先使用先出现厚垣孢子的。  5 原种和栽培种的筛选  生产原种和栽培种之前,在接种前48h,取出保藏菌种置于29~31℃下恢复培养。  原种的筛选标准:以生长速度、菌丝色泽和健壮程度、厚垣孢子出现早晚为基准;采用标准棉子壳配方29~31℃培养,一般48~72h封面,8~10d长满,12~15d出现厚垣孢子,10d内未长满的淘汰;菌丝纤细有力呈银灰色的保留,菌丝变浓白或局部变浓白的的淘汰;由于配方以及含水量的不同,上述参数会有所不同,根据实际情况选择菌丝外观好生长速度快的原种,出现厚垣孢子早的更好。  栽培种的筛选与原种基本相同,差异在时间上,一般使用标准配方在29~31℃培养,48h封面,7~10d长满,11~14d出现厚垣孢子,10d内未长满的淘汰。  6 菌种保藏期限  草菇母种出现厚垣孢子之后立即置于18~22℃环境避光保藏,30d内使用最佳,最长不超过60d,草菇原种出现厚垣孢子之后立即置于18~22℃环境避光保藏,20d内使用;草菇栽培种出现厚垣孢子之后最好立即使用,18~22℃下保藏前3天效果最佳,最多存放7d。  注意事项:①在草菇上使用的试管培养基,要注意以下几点:a.培养基在配制至分装前,做到搅拌均匀,防止因试管内营养差异影响对菌丝优劣的判断;b.试管培养基灭菌后冷却、摆斜面时要防止出现大量冷凝水,培养基温度在55~60℃的时候出锅,温度过高冷凝水多,温度过低容易凝固;斜面摆好后要立刻覆盖一些洁净的保温材料,防止凝固时产生大量冷凝水;如果少量定型的斜面存在冷凝水,应剔除;如果大多数试管都产生冷凝水,可在较密闭的干净箱体内放置干燥剂(如生石灰块)对试管进行干燥,待斜面上冷凝水除去后立即停止干燥。②际准草菇菌种配方:棉子壳84%,麸皮12%,轻质碳酸钙2%,生石灰2%,料水比1∶1;灭菌后pH≤6.0。根据棉子壳的质量优劣,酌情添加1%蔗糖。③周期的安排:在各个环节都稳定的情况下,一般组织分离、出菇试验90d做一次,如果出现高产菇房,立即做组织分离和出菇试验。一次组织分离到出菇试验结束需要40d,每次接试管到出现厚垣孢子需要7~10d,每次转管出现厚垣孢子保藏20d需要进行下1次转管(每次转管的尽量在保藏1个月内使用),允许转管3次。

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